Alla scoperta dei modelli animali: la rana

Sapevate che tra gli organismi modelli compaiono anche gli anfibi? Lo Xenopus laevis non è però una semplice rana: di provenienza del Sud Africa, rappresenta l’organismo modello perfetto per gli studi di embriologia perché produce molte uova e di grandi dimensioni. Questo animale è anche molto resistente, infatti si possono prelevare le sue ovaie (che costituiscono il 40% del peso della femmina) tramite un taglio nel ventre. Non è però un organismo utile per studi di genetica a causa del genoma tetraploide [1] che ne rende complicata la manipolazione.

Non tutti sanno che questo animale venne a lungo utilizzato come test di gravidanza perché iniettando una piccola quantità di urina di donna umana nella rana, nel caso essa fosse incinta e la sua urina contenesse gonodotropina corionica (hCG), lo xenopus avrebbe deposto le uova il giorno dopo.

Fonte: https://www.semanticscholar.org/paper/The-xenopus-pregnancy-test.-Polack/b9031d4c8bab5b33b1f6beed405a126e85d63b76/figure/0

Il ciclo vitale dello Xenopus

Lo sviluppo embrionale di X. leavis è conservato in altri organismi filogeneticamente superiori. Per arrivare da uova fertilizzate a un adulto, le cellule devono crescere, differenziarsi e sviluppare un pattern cellulare specifico per ogni tessuto. Durante la crescita dell’embrione si osservano dei fenomeni di morfogenesi, con cambiamento della forma delle singole cellule e movimenti di interi gruppi di cellule. 

Dalla fertilizzazione in tre ore, le divisioni delle cellule portano alla formazione di una pallina cava, la blastula, senza crescita tra una divisione e l’altra. Le pareti di questa sfera si introflettono fino a formare la gastrula e successivamente un’altra struttura chiamata neurula in cui compare l’abbozzo del sistema nervoso. Si ha quindi la formazione di un piccolo embrione che comincia ad allungarsi con la formazione dei somiti [2]. Si trasforma poi in girino allo stadio natante  (swimming tadpole). Questa larva non è ancora in grado di nutrirsi autonomamente ma prende il cibo dal tuorlo residuo dell’uovo degradandone le proteine. In pochi giorni, la porzione ventrale forma un tubo intestinale,  l’apertura boccale  e l’abbozzo di cuore e reni. Questi due organi in particolare sono essenziali per la circolazione del nutrimento derivante dal tuorlo in tutto il corpo della larva nonché per mantenere l’omeostasi [3]. Dopo 12 mesi avremo finalmente un adulto maturo.

Rana da Nobel

Nel 1935 Hans Spemann vinse il Nobel per la “scoperta dell’effetto organizzatore nello sviluppo embrionale”. https://www.nobelprize.org/prizes/medicine/1935/summary/

Nel 2012 Sir John B. Gurdon e Shinya Yamanaka vennero insigniti del premio per la “scoperta che le cellule mature possono essere riprogrammate in pluripotenti”. Il secondo in particolare scoprì il cosiddetto “cocktail di Yamanaka” per indurre la formazione delle cellule staminali pluripotenti indotte (iPS) mentre Gordon creò i primi cloni di vertebrati. Dopo aver raccolto cellule differenziate dalla pelle di rana, ne trapiantò i nuclei in cellule uovo ottenendo cloni. La rana quindi risulta essere il primo animale clonato, già molto prima della famosissima pecora Dolly. https://www.nobelprize.org/prizes/medicine/2012/summary/

Lo Xenopus nella ricerca scientifica

Si possono sfruttare gli ovociti di Xenopus per diversi fini. In neurobiologia per esempio li si usa per esprimere canali ionici, proteine transmembrana che favoriscono il passaggio di ioni dall’interno della cellula verso l’esterno e viceversa, e recettori. Si inietta un RNA nell’ovocita che produce la proteina che viene esposta in superficie o attraverso la membrana. In seguito si adopera la tecnica del patch clamp in cui si pone un elettrodo dentro alla cellula e un altro fuori per misurare il flusso ionico. Possono inoltre essere sfruttati per produrre molte proteine secretorie come fattori di crescita (es. il TGF-β).

Le uova invece sono prodotte per stimolazione con hCG e vengono usate per lo studio degli stadi di sviluppo embrionale come la determinazione degli assi di simmetria dell’embrione, la differenziazione cellulare, il controllo della comunicazione cellula-cellula e la morte cellulare programmata. Si possono studiare inoltre l’espressione dei geni, l’effetto conseguente al loro silenziamento, la regolazione trascrizionale in vivo, la scoperta di nuovi geni e dei processi coinvolti nella tumorigenesi.

Per studiare la funzione di un gene se ne modifica l’attività ad esempio con uno studio di loss-of-function, cioè bloccando la sua funzionalità, mediante l’utilizzo di iRNA (interference RNA) o con l’utilizzo del cosiddetto morfolino. La prima tecnologia si basa sull’introduzione nella cellula di un RNA a doppio filamento sintetico che determina la degradazione specifica di un mRNA bersaglio. In tal modo si agisce bloccando il gene prima che questo venga tradotto in una proteina. Il morfolino invece è un nucleotide in cui anziché il ribosio si trova una molecola modificata. Non essendo un acido nucleico è resistente a enzimi interni alla cellula deputati alla degradazione dei nucleotidi. Un esempio di applicazione del morfolino è sul gene che codifica per la proteina chiamata Sizzled (Szl). Il blocco della funzione di questa proteina ha dirette conseguenze sullo sviluppo embrionale e sulla formazione delle cosiddette blood islands [4].

È possibile usare lo Xenopus per saggi di differenziamento che consistono nella raccolta di cellule staminali pluripotenti e nell’induzione della loro differenziazione ai fini di studiare gli step molecolari di questo processo. Possono essere effettuati anche saggi di migrazione cellulare, cioè studi del comportamento collettivo delle cellule che non si muovono in modo autonomo ma in gruppi durante lo sviluppo embrionale. Questi comportamenti possono essere studiati in vitro a partire da espianti [5] in una capsula Petri contenente sostanze in grado di distruggere le giunzioni cellula-cellula. Osservando la struttura espiantata si osserva che questa tende autonomamente a estendersi e le sue cellule a migrare.

Altra tecnica adoperata con questo organismo è l’estrattologia. Si tratta della ricostruzione dei processi fisiologici che avvengono all’interno della cellula analizzando un estratto di citoplasma (la componente della cellula che circonda il nucleo e in cui sono immersi tutti gli organelli) caratterizzato da proteine dette fattori citostatici [6] che bloccano le cellule in una specifica fase del ciclo cellulare, la metafase [7].
Per attuare tale tecnica è necessario, prima di tutto, raccogliere le uova, privarle della gelatina che le avvolge quando la rana le depone e centrifugarle in un apposito macchinario, cioè sottoporle a rapidi movimenti rotatori in modo da rompere le uova e successivamente le cellule e separare le componenti più dense dalle meno dense. 

I costituenti delle cellule si dividono in tre strati: sul fondo si trovano le proteine del tuorlo, nuclei, mitocondri e altri organelli mentre in superficie si trovano le membrane che avvolgevano le cellule. Il nostro citoplasma si concentra invece nello strato intermedio e quindi a questo punto può essere raccolto. Aggiungendo a questo estratto i nuclei degli spermatozoi e la tubulina fluorescente, si forma un fuso mitotico [7].

Aggiungendo il calcio invece si mima la fecondazione in quanto risultano rimossi i fattori citostatici che bloccano le cellule (come la ciclina B) e vi sarà l’entrata nello stadio successivo del ciclo cellulare, l’anafase. Tramite gli estratti viene quindi studiata la corretta segregazione dei cromosomi durante il ciclo cellulare, necessaria per l’integrità del genoma e per evitare quindi l’insorgenza di patologie come i cancri.

Per approfondire

• https://www.jove.com/v/51526/understanding-early-organogenesis-using-simplified-situ-hybridization
• https://www.jove.com/v/51425/reconstitution-of-catenin-degradation-in-xenopus-egg-extract

Glossario

[1] Tetraploide:  condizione aberrante di cellule i cui nuclei contengono quattro assetti cromosomici completi

[2] Somiti: sono masserelle simmetriche che si formano durante lo sviluppo dell’embrione dopo la prima fase di formazione dei tre foglietti embrionali (endoderma, mesoderma, ectoderma).

[3] Omeostasi: comportamento dei viventi a mantenere intorno a uno specifico livello il valore di alcuni parametri interni, nonostante il continuo influsso di fattori esterni e interni.

[4] Blood islands: strutture primordiali intorno all’embrione che portano allo sviluppo di diverse parti del sistema circolatorio.

[5] Espianto: frammenti di organo o di tessuto proveniente da organismi viventi che possono essere analizzati in vitro

[6] Fattori citostatici: molecole in grado di bloccare il metabolismo e il processo proliferativo della cellula

[7] Metafase: fase del ciclo cellulare in cui i cromosomi si allineano lungo il piano equatoriale della cellula prima di dividersi nelle rispettive cellule figlie grazie alla presenza di un insieme di proteine e microtubuli che formano il fuso mitotico