Alla scoperta dei modelli animali: lo zebrafish
Il nostro viaggio alla scoperta degli animali modello ci porta oggi a imbatterci in un pesciolino, lo zebrafish (Danio rerio). Si tratta di un pesce teleosteo, cioè dotato di scheletro osseo, della famiglia dei Ciprinidi di dimensioni minute ma molto robusto. E’ una specie nativa dell’Asia meridionale ed è ampiamente diffusa in habitat di acqua dolce.
Lo zebrafish
Essendo facilmente manipolabile viene utilizzato per studiare lo sviluppo e la funzione di cervello e sistema nervoso in generale, i difetti congeniti e il cancro.
Una delle caratteristiche più peculiari dello Zebrafish è quella di rigenerare diversi tessuti del corpo in modo molto efficiente dopo una lesione (ad esempio a seguito della resezione [1] fino a un terzo del ventricolo cardiaco). Questo lo porta a essere un animale modello molto studiato per le sue abilità rigenerative (nella speranza di poter in futuro indurre la rigenerazione di tessuti complessi anche nell’essere umano). Inoltre la conservazione della disposizione e della funzione degli organi interni permette un confronto diretto con quelli degli esseri umani.
Il nostro pesciolino, che ricade nella categoria dei vertebrati, è quindi utile a una miriade di scopi. Ma come mai allora gli animalisti non protestano per il suo utilizzo e anzi il Ministero della Salute finanzia progetti categorizzandolo come metodo alternativo alla sperimentazione animale? Saranno un pochino specisti? (https://www.izsler.it/pls/izs_bs/v3_s2ew_consultazione.mostra_pagina?id_pagina=2638)
Vita da stabulario
Negli stabulari questa specie è nutrita soprattutto col crostaceo Artemia salina e viene mantenuta in sistemi modulari a ricircolo d’acqua, cioè vaschette dove l’acqua viene fatta ricircolare attraverso una serie di filtri per essere pulita dai cataboliti [2], dalle feci, dai residui di cibo e dai composti chimici dannosi. Sebbene lo Zebrafish possa sopportare un ampio range di temperatura dell’acqua, quella ottimale per la crescita e l’accoppiamento è compresa fra 24-28 °C. Negli stabulari la temperatura è mantenuta solitamente a 28° C principalmente per due motivazioni: è un pesce di acqua calda e i lavori svolti sullo sviluppo embrionale vengono svolti a 28,5° C che rappresenta la temperatura standard di riferimento.
Il ciclo vitale
Uno dei principali motivi per il quale questo pesciolino viene sfruttato come organismo modello è il suo rapido processo di sviluppo (poiché in soli cinque giorni abbiamo lo sviluppo degli organi principali) e un tempo di generazione relativamente breve (dall’uovo all’adulto fertile intercorrono all’incirca 3 mesi). E’ ingente anche la quantità di prole prodotta poiché nel periodo riproduttivo la femmina depone dalle 3 alle 400 uova.
Inoltre gli embrioni del pesce sono trasparenti e si sviluppano all’esterno della madre in acqua.
La schiusa delle uova avviene in 48-72 ore. Abbiamo quindi lo sviluppo dell’embrione e a partire dal 5° giorno post fertilizzazione, si ha una fase larvale fino al 21-28°. Si passa poi alla fase giovanile fino alla maturità sessuale (3°-6° mese).
Gli adulti di zebrafish hanno una lunghezza di 4 cm e mostrano dimorfismo sessuale [3]. Le femmine risultano essere infatti leggermente più grandi, di un colore argentato più intenso e di forma più arrotondata. I maschi invece presentano delle strisce più marcate di colore bluastro vivace sul dorso del corpo.
Applicazioni di Zebrafish nella ricerca scientifica
Lo zebrafish diventò un organismo modello per la ricerca verso la fine degli anni ’60 grazie al ricercatore George Streisinger della Oregon University che lo utilizzò per studi di biologia dello sviluppo. Dagli anni ’90 è stato utilizzato per sviluppare due grandi mutanti genetici, uno da parte della vincitrice del premio Nobel Christiane Nusslein-Volhard a Tubinga (Germania) e l’altro da Wolfgang Driever e Mark Fishman a Boston (USA).
Lo zebrafish è molto utilizzato per lo studio di patologie umane, in particolare:
- Malattie neurodegenerative, soprattutto Alzheimer
- Malattie congenite del cuore
- Malattia del rene policistico
- Distrofia muscolare di Duchenne
- Studio del cancro, soprattutto leucemia e melanoma
Viene attualmente adottato per la tecnica del reverse screening che consiste nel silenziamento di un gene d’interesse per osservare la comparsa di un fenotipo patologico umano. Si possono ad esempio indurre mutazioni dei geni coinvolti nella Nemaline miopathy, malattia neuromuscolare congenita ereditaria che nell’uomo provoca debolezza muscolare e alterazione del sistema osseo. In zebrafish viene modificata la forma del corpo, che si curva all’indietro per un’alterazione a livello muscolare, e l’aspetto delle fibre muscolari della coda. Inoltre possono essere simulate patologie del sistema immunitario grazie alla mutazione di Wasp, essenziale nell’organizzare la migrazione cellulare.
Come anticipato, lo zebrafish adulto viene studiato nei meccanismi che esso adotta per la rigenerazione cardiaca. Ai fini di riprodurre problemi cardiaci umani come le ischemie [4], il suo cuore viene danneggiato in laboratorio tramite rimozione chirurgica o crio-danneggiamento, cioè viene utilizzato l’azoto liquido per creare un danno da congelamento. In un mese si ha la completa rigenerazione del muscolo cardiaco. Da studi effettuati su questo processo, è emerso che l’ enzima telomerasi (responsabile del mantenere integre le estremità dei cromosomi) è essenziale nella rigenerazione. Se infatti viene silenziato il gene codificante questa proteina, il cuore è in grado di svilupparsi normalmente ma non osserviamo rigenerazione.
Zebrafish e cancro
Che i pesci sviluppassero tumori spontaneamente era noto già da molto tempo ma che zebrafish fosse un buon modello per studiarli fu suggerito solo in seguito a studi di carcinogenesi [5] indotta da agenti chimici e grazie alla messa a punto delle metodologie di transgenesi [6]. Quest’ultima in particolare induce lo sviluppo di tumori quasi del tutto comparabili a quelli umani sia dal punto di vista istologico [7] che genetico. Studi molto importanti sono quelli avvenuti per il melanoma: si produce un animale transgenico in cui si altera nei precursori dei melanociti (le cellule della pelle) il gene BRAF, quello più frequentemente mutato nell’essere umano provocando una iper-proliferazione dei melanociti.
Una delle principali caratteristiche dei tumori come il melanoma è quella di riacquisire proprietà staminali.
Crestin ad esempio è una proteina espressa dai precursori dei melanociti e viene persa progressivamente durante lo sviluppo. Mediante l’utilizzo della EGFP (proteina fluorescente) fusa alla proteina crestin è possibile osservare le cellule in cui è tale proteina è espressa: essa risulta essere presente non solo nei progenitori dei melanociti ma anche nelle cellule di melanoma. La riespressione di crestin nei melanociti significa quindi che i melanociti hanno recuperato lo stato embrionale primitivo e precoce per sviluppare il melanoma.
Il fantasma zebrafish
Il Casper fish è una variante trasparente di zebrafish. Mediante radiazioni è stato rimosso il suo sistema immunitario e gli sono state trapiantate cellule tumorali o addirittura embrioni da un altro pesce donatore.
Viene utilizzato per:
- testare nuovi farmaci,
- quantificare il grado di aggressività (quindi formazione di metastasi) in un tipo di melanoma
- studiare la neoangiogenesi [8]
- testare anche i shRNA (short hairpin RNA, sequenza di RNA che, curvandosi, forma una struttura che ricorda una forcina, solitamente utilizzato per il silenziamento dell’espressione genica).
Glossario:
- [1] Resezione : asportazione parziale di un organo
- [2] Catabolita: residui della demolizione dei nutrienti, principalmente delle proteine
- [3] Dimorfismo sessuale: differenza morfologica fra individui appartenenti alla medesima specie ma di sesso differente
- [4] Ischemia: carenza dell’afflusso di sangue a un distretto dell’organismo, con conseguente sofferenza dei tessuti
- [5] Carcinogenesi: processo di formazione e sviluppo dei tumori
- [6] Transgenesi: inserimento di un gene esogeno all’interno del genoma di un organismo bersaglio che funge da ospite
- [7] Istologia: branca della biologia che studia la struttura microscopica dei tessuti e degli organi vegetali e animali
- [8] Neoangiogenesi: formazione di nuovi vasi sanguigni
